癌症疫苗能够刺激机体产生特异性免疫性应答，尤其是针对肿瘤抗原的特异性CD8^＋的细胞毒T细胞。1994年到1995年间生产的最早的癌症疫苗主要应用于非突变抗原患者中，结果显示肿瘤相关抗原具有一定的免疫原性，而且能够诱导少数晚期癌症患者产生临床反应。过去10年来，技术的发展使我们能够研发针对癌症患者特异性突变抗原的疫苗。多种癌症疫苗正在研发中，包括多肽、蛋白质、抗原提呈细胞(APCs)、肿瘤细胞和病毒载体疫苗。目前肿瘤的标准治疗包括外科、消融、化疗、放疗，都能诱导机体产生抗肿瘤免疫，因此我们认为这些治疗也具有一定的癌症疫苗的效应。通过监测肿瘤患者接受标准治疗前后免疫应答能力的变化，我们找到了肿瘤免疫的生物标志物。正在进行临床试验的联合治疗方案有望成为改善患者预后的最佳策略。

缩略语

CEA：癌胚抗原

GM-CSF：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

HPV：人乳头瘤病毒

HMGB1：高迁移率族蛋白B1

hTERT：人端粒酶逆转录酶

IFA：弗氏不完全佐剂

IL：白介素

KLH：钥孔血蓝蛋白

MDSC：髓源性抑制细胞

NCI：美国国家癌症研究所

PADRE peptides：泛DR结合肽合成辅助肽

PSA：前列腺特异抗原

TLR：Toll样受体

Treg：循环调节性T细胞

引言

癌症是西方国家居民主要的死亡原因之一，其中最常见的是肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌。随着人口构成和治疗手段的变化，甲状腺癌、肝癌和胰腺癌的发病率将会显著增加。每种组织类型的肿瘤都有不同的分子亚型，各亚型有不同的基因突变类型和表达方式。临床上治疗肿瘤的方法有很多，包括外科治疗、放疗、化疗和小分子信号通路抑制剂(比如针对恶性黑色素瘤BRAF基因突变的威罗菲尼)，每一种方法可以用于特定的临床阶段。更值得关注的是每一种"标准治疗"都具有调节抗肿瘤免疫的作用。

几十年前，我们就知道尽管绝大部分肿瘤没有特异的病原体，机体免疫系统也能够自发的产生抗肿瘤免疫。在黑色素瘤和肾癌中出现肿瘤浸润淋巴细胞(TILs；见术语表)提示预后良好。最近有研究表明，CD8^＋的记忆T细胞(见术语表)是结直肠癌预后良好的重要因素，之前我们认为结直肠癌是一种不能产生免疫性的肿瘤类型。TILs也是乳腺癌和卵巢癌预后良好的因素。

癌症疫苗的生产需要许多技术，包括抗肿瘤免疫的启动、扩增或者偏移(或融合)。为了达到这个目标，许多方法都应用了肿瘤抗原，通常是将肿瘤抗原与抗原提呈细胞(APCs)或其他免疫调节细胞联合应用，或者直接应用灭活的肿瘤细胞。

更值得关注的是，标准抗癌治疗(手术、消融、化疗和放疗)以及小分子信号通路抑制剂(见术语表)有着与癌症疫苗类似的效应。这些治疗手段通过增加病灶中肿瘤抗原的表达或者是坏死肿瘤细胞抗原的释放，从而增强机体抗肿瘤免疫使患者获益。

本文对肿瘤疫苗领域进行了综述，包含有各类肿瘤抗原、诱导抗肿瘤免疫的方法，以及目前基础研究和临床研究的进展。同时还探讨了促使机体产生抗肿瘤免疫的标准治疗。文章还阐述了目前该领域存在的争议，以及在临床试验中精确监测患者免疫功能的重要性。

癌症的流行病学

癌症居于世界居民死亡原因的首位。目前，每年有超过820万例患者死于癌症，现在全球新发癌症病例在每年1 400万左右，预计在20年后这个数据将增加到2200万。全球最常见的肿瘤类型有肺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌和乳腺癌。在美国最常见的肿瘤类型是前列腺癌或乳腺癌、肺癌和结直肠癌，死亡率最高的是肺癌、乳腺癌或前列腺癌、结直肠癌和胰腺癌。不同类型的肿瘤以及同一肿瘤在不同患者中的分子生物学特征各不相同，非常复杂。因此尽可能地采取个体化治疗可能会使患者获益最大。肿瘤的治疗从依赖组织学逐渐向根据特定肿瘤基因突变分类治疗的方向转化。比如抗HER2抗体(曲妥珠单抗)一开始仅用于乳腺癌的治疗，但是现在可以用于其他HER2基因扩增肿瘤的治疗。

资料和纳入标准

2014年5月和6月，笔者在PubMed输入"cancer vaccine"和"immunotherapy and cancer"检索最近5年发表的相关文献，同时还检索了WHO和美国癌症协会网站的最新数据，以及2013年癌症免疫治疗协会(SITC)、2013和2014年美国临床肿瘤学会(ASCO)会议的相关文献。英语类杂志中发表的有关肿瘤疫苗的专家评议也在纳入范围内，有相关临床研究的将优选。笔者还优先选择了含有免疫监测和免疫应答生物学标记物的研究。

癌症疫苗策略

肿瘤抗原疫苗：包括肿瘤特异抗原(TSA)和肿瘤相关抗原(TAA)

目前最常用的肿瘤疫苗策略是应用不同患者共同表达的抗原制备疫苗。最早发现的肿瘤相关抗原(TAAs；见术语表)是一种蛋白质，这种蛋白质在肿瘤细胞中过度表达，但是很少在正常组织中表达。我们可以通过编码表位蛋白的基因克隆来鉴别肿瘤抗原，具有肿瘤活性的TILs能够识别这些表位(见术语表)。

最初用于肿瘤疫苗的抗原包括：过度表达的抗原、肿瘤-睾丸抗原(C-T抗原)、胚胎抗原、基因突变所致的抗原(或者肿瘤特异抗原)(表1)。

过度表达的抗原

过度表达的抗原是一种在DNA、mRNA或者蛋白质水平过度扩增的蛋白质，因此他在肿瘤组织中的含量要远高于临近的正常组织。包括癌胚抗原(CEA：结直肠癌以及其他癌种)、前列腺特异性抗原(PSA:前列腺癌)、Her2/neu (乳腺癌)，黑色素瘤相关抗原比如MART-1/Melan-A、酪氨酸酶，以及gp100 (见术语表)和黏蛋白1 (多种肿瘤包括结直肠癌和前列腺癌)。所有这些疫苗在体外和老鼠模型中都表现有效，也开展了一些通过实体瘤RECIST标准进行疗效评价的临床试验。我们可能需要转变过去一直认为自身正常抗原比如TAAs与特异性T细胞亲和力(见术语表)最高的观点，因为他们的疗效以及与活化T细胞的亲和力都不如这些过度表达抗原。

术语表

免疫佐剂：本身不具抗原性，但能增加机体对相关抗原的特异性免疫应答。免疫佐剂的成分含有病原体、免疫细胞生长因子和组织损伤因子。

异体细胞系：来自非患者本人的细胞系；自体细胞系指来自患者自身的细胞系。

抗原提呈细胞（APC)：通过各种机制处理和提呈MHC Ⅰ类和MHC Ⅱ类分子的相关蛋白质，然后分别激活CD8⁺和CD4⁺T细胞。抗原提呈细胞包括树突状细胞、B细胞、单核细胞和巨噬细胞。

亲和力：抗原与抗体结合的能力。

嵌合抗原受体（CAR)疗法：运用T细胞抗体受体复合物，通过T细胞受体的信号通路，重新定位转染细胞作用于该抗体的特定部位。

CD8⁺T细胞：具有细胞毒性（杀伤细胞）或分泌细胞因子(和其他分子)的T细胞。这类细胞通过识别细胞表面的MHCⅠ类分子复合体而激活。

CD4⁺T细胞：一种能分泌细胞因子的辅助T细胞，支持和辅助T细胞和B细胞的功能。

检查点阻断：利用抗体阻断免疫反应中作为检查点的分子，例如使用抗CTLA-4抗体（抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)和抗PD-1抗体（抗程序性死亡分子1)或抗PD-L1抗体（抗抗程序性死亡分子1配体1)。

CpG分子：DNA分子磷酸基团之间富含胞嘧啶和鸟嘌呤的部分。

表位：指MHC Ⅰ类和Ⅱ类分子蛋白或多肽中为APCs所处理和提呈的部分，能够被CD8⁺和CD4⁺T细胞表面表达的T细胞受体所识别。CD8⁺T细胞识别MHC Ⅰ类分子的8 ~1 1个氨基酸长度的多肽，CD4⁺T细胞识别MHC Ⅱ类分子中较长的(13~17氨基酸）多肽。

外来病原体模式识别受体：一种能够识别大多数病原体共有的病原分子的受体，如脂多糖或鞭毛。

外源性辅助蛋白：一种促进机体产生非特异性免疫的外源性蛋白，能够辅助或者协助特异性的免疫应答。

G-Vax：一种能分泌大量粒-巨噬细胞集落刺激因子的肿瘤细胞。

异源辅助肽：一种用来激活抗非肿瘤相关蛋白（如破伤风类毒素）CD4⁺T细胞的多肽，目的是通过破伤风特异性CD4⁺辅助T细胞来促进肿瘤特异性CD8⁺T细胞的杀伤作用。

诱导中和抗体反应：一种阻止其他蛋白之间相互作用的抗体反应。

MART-1/Melan-A、酪氨酸酶和gp100：黑色素瘤中过度表达的抗原。

MHC Ⅰ类和Ⅱ类分子：是某种组织类型所特有的主要组织相容性分子。

MHC限制性：MHCⅠ类分子提呈胞内多肽给CD8⁺T细胞；MHCⅡ类分子提呈细胞外多肽给CD4⁺T细胞。

MHC限制性表位：指经过一系列步骤消化处理后的短的线性氨基酸序列，涉及了多种细胞内蛋白酶，使之与个体表达的特异性MHC分子多肽结合沟槽结合。

溶瘤病毒：病毒在复制过程中裂解宿主肿瘤细胞。

Prime boost：指用一种疫苗启动免疫应答，然后用不同类型的疫苗来加强应答反应。

聚肌苷酸-聚胞苷酸(PolylC):由肌苷酸和胞苷酸二聚体组成的双链RNA分子；PolylCLC由多聚赖氨酸与肌苷和胞嘧啶分子复合而成的双链RNA分子，以此来模拟病毒感染。

小分子信号通路抑制剂：抑制细胞内信号转导通路的小分子药物。

病毒早期基因转录反式激活因子：病毒感染人体后早期表达的基因，这些基因能够激活其他的病毒基因。

转染：将DNA或RNA转到细胞中。

肿瘤浸润淋巴细胞（TILs)：主要由CD8⁺和CD4⁺T细胞主动浸润肿瘤病灶。还可含有B细胞、自然杀伤细胞或抑制细胞。

肿瘤相关抗原（TAA)：肿瘤细胞表达的具有免疫原性的蛋白质。

WT-1：Wilms瘤基因1——多种肿瘤表达的一种肿瘤相关抗原。

C-T抗原

C-T抗原在大部分肿瘤组织和生殖细胞中表达，这种特性使他能够逃避机体的免疫监视。C-T抗原包括MAGE-A、MAGE-B、MAGE-C大家族和NY-ESO-1。人类临床试验(由于C-T抗原在小鼠中不表达所以无法进行小鼠模型的动物实验)表明C-T抗原疫苗具有一定的临床疗效。

肿瘤胚胎抗原

肿瘤胚胎抗原是一种正常的胚胎抗原，他在机体生长发育的过程中逐渐消失，但是在一些癌变细胞中又重新激活；包括癌胚抗原和甲胎蛋白。这类抗原在体外、小鼠模型以及临床试验中都显示具有免疫原性，并且达到了预期的疗效。

2008年美国国家癌症研究所(NCI)组建了一个团队，对当时已有的肿瘤抗原进行分类排名。并出版了排名靠前的和为最多实验证实的肿瘤排斥抗原。大部分抗原是非突变的共有抗原。他们依据商定的标准进行排序，包括治疗作用、免疫原性、致肿瘤性、在肿瘤病灶和患者中过度表达的频率，以及在肿瘤干细胞中的表达程度。所有这些抗原中没有一种是肿瘤所特有的。

几十年前我们就已经知道肿瘤的特异性突变，常见的有RAS原癌基因和P53抑癌基因。然而这种突变很难使机体处理和提呈常见的MHC Ⅰ类和Ⅱ类分子的MHC限制性表位，并使这些表位具有免疫原性。因此很难鉴别出这种特异性突变抗原，也不可能在临床试验中产生特异的疫苗。但是随着测序技术的提高和能够检测处理和提呈抗原软件的应用，以及结合多肽表位的技术提高，使得我们能够制备针对患者特异性突变的高疗效的T细胞。目前鉴别出肿瘤患者特异性突变的靶抗原需要很长时间，这最终延误了患者的治疗。于是有一些研究者正在专注于研究快速鉴别出特异性突变的方法。

自体肿瘤细胞疫苗

自体肿瘤细胞疫苗是将患者的肿瘤细胞在体外培养制备疫苗，然后将疫苗输入该患者的体内。该种疫苗将包含所有的肿瘤特异性突变，包括灭活的肿瘤细胞、能够提高机体免疫力的细胞因子如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、添加或不添加佐剂(见术语表)的肿瘤溶解产物，或者加有APCs如树突状细胞的肿瘤溶解物。

肿瘤能够表达大部分正常的自身蛋白，如果机体正处在免疫应答的环境中，这些蛋白能够促进自身免疫反应。这对肿瘤特异性突变并不是必须的，但是可以运用于肿瘤疫苗的制备。目前鉴别肿瘤患者的特异性靶突变仍然面临着重重技术障碍，许多研究者致力于研究如何利用这些突变抗原，并证实了这些抗原能够诱导强大的免疫应答。

决定基扩展

尽管鉴别出一种肿瘤的优势抗原对于抗肿瘤免疫是非常重要的，但是研究显示好的临床疗效却取决于在同一组织中免疫应答从一种抗原向另一种抗原扩展(决定基扩展或表位扩展)。这种自发现象已经在自身免疫性疾病中进行了研究，肿瘤免疫治疗也在重视这方面研究。

肿瘤抗原活跃的交叉提呈现象促使机体释放大量的T细胞，随后产生针对不同抗原的抗肿瘤T细胞，这可能是肿瘤排斥反应发生的重要机制(图1)。针对一种共有抗原的疫苗能促进机体产生一系列的未知的肿瘤特异性突变抗原，而且有可能诱导临床上重要的肿瘤排斥现象。许多临床试验表明疫苗交互抗原与临床疗效无关，这可能与上述机制有关。含有肿瘤相关抗原(TAAs)的肿瘤疫苗的关键作用可能是诱导肿瘤特异性抗原决定基扩展，从而产生更多的高亲和力的T细胞，因此有效地调节肿瘤排斥反应。这种交叉免疫机制可能会激活机体的自身免疫，我们发现干扰素可以作为判断黑色素瘤患者临床疗效的一种生物标志物。

许多抗原可用来制备肿瘤疫苗，但是关键环节可能是免疫激活的方法和载体。

肿瘤疫苗的种类

大部分肿瘤疫苗旨在刺激机体产生特异性CD8^＋的杀伤性T细胞，因为小鼠实验表明这些细胞在免疫治疗中发挥着关键的作用。

TAAs限制性多肽表位的MHC Ⅰ类分子是最常见的用于活化CD8^＋T细胞的疫苗策略。这些疫苗同时产生了大量的副产物(包括细胞因子和TLR配体)，从而促进内源性APCs对这些抗原的呈递。

肿瘤多肽疫苗的优势在于能够利用计算机运算确定TAAs限制性多肽表位的MHC Ⅰ类分子的氨基酸序列。然后检测这些候选表位能否与共同表达的HLA分子相结合。当然这些表位必须能够被肿瘤细胞处理和提呈，而且具有免疫原性(即能激活CD8^＋T细胞)。其中许多抗原[鼠自身同源抗原，与人类抗原高度相似的抗原，或是转染(见术语表)或转基因小鼠抗原]都在小鼠模型中进行了实验，结果发现他们的确是影响治疗效果的肿瘤排斥抗原。

刺激机体产生TAAs特异性CD8^＋T细胞包括自体APCs如树突状细胞也是较常见的一种基于TAAs的疫苗策略。该策略的理论基础是肿瘤对内源性APCs有抑制作用。在体外优化的APCs能够有效地提高抗肿瘤T细胞的应答能力，这个过程不需要肿瘤因子的参与，但是需要有特异性的生长促进因子和免疫信号通路分子。

还有一种基于肿瘤细胞的癌症疫苗策略就是与细胞因子如GM-CSF或免疫佐剂(也可二者都有)偶联使用，因此常常是包含有肿瘤特异性突变抗原在内的许多半抗原组成的复合物。这些细胞携带有患者全部的肿瘤特异性突变和所有的MHC Ⅰ类和Ⅱ类分子。还有一种方法利用病毒天然的高传染性感染能够编码肿瘤抗原的细胞。基于病毒的疫苗策略还包括使用溶瘤病毒(见术语表)在肿瘤细胞内特异性复制(图2)。

Dendreon公司生产的一种癌症疫苗Sipuleucel-T已经为美国食品药品管理局(FDA)批准上市。该疫苗含有载有TAA前列腺酸性磷酸酶和GM-CSF的自体APCs。大样本的Ⅲ期临床试验结果显示该疫苗能将晚期转移性前列腺癌患者的总生存期提高4.1个月。

多肽疫苗

利用共有TAAs的MHC Ⅰ类分子的限制性多肽表位激活特异性CD8^＋T细胞克隆，从而反作用于自身抗原是最常见的癌症疫苗策略之一。来自动物模型的数据显示这类抗原可能具有很好的临床疗效。

含有多肽的免疫佐剂(如与不完全免疫佐剂相似的Montanide)联合或不联合细胞因子，如GM-CSF和白介素γ或TLR激动剂，在临床试验中显示了一定的疗效(部分缓解、治愈或持久的疾病稳定状态)。一些小样本试验表明，APCs如树突状细胞上的多肽具有临床疗效，而且能够增强免疫力。

基于一种或几种多肽的疫苗能够单独运用也可联合免疫佐剂Montanide ISA-51与细胞因子(GM-CSF激活APCs)，或者联合其他的免疫佐剂(如特异性TLR配体激活并催熟APCs)，或者联合添加多肽的自体APCs(等类似的联合应用方法)。Montanide ISA-51是一种乳化剂中的油分子，其与动物实验中应用的IFA相似，能够激活TAA特异性的细胞毒T细胞。实验显示，牛组织来源与橄榄油来源的Montanide产物具有不同的免疫佐剂性能。最近有人认为，IFA能使T细胞累积于注射疫苗的局部，但不能增强整个免疫系统功能。因此与多肽疫苗一样，仍需要更多的研究来寻找最好的免疫佐剂及相关的疫苗。本文总结了最近所有的多肽疫苗相关的临床试验。

多肽疫苗的优点是9至10个氨基酸组成的多肽生产简单，而且价格实惠。因此可以大规模的生产，而且多肽的稳定性使其便于储存和转运。

然而其缺点是，由于受到HLA的限制，使得不表达共有型HLA的患者不能接受多肽疫苗的治疗。此外，常见的MHC Ⅰ类分子与短肽结合不能激活CD4^＋T细胞，这就限制了CD8^＋细胞毒T细胞的效应。为了解决这个问题，我们可以加入特异性的非肿瘤佐剂(包括血蓝蛋白、破伤风类毒素或者泛DR结合肽合成辅助肽)，但是这些数据只是来自于外源性辅助蛋白(见术语表)。

另一种策略就是运用合成的多肽已经取得了显著的临床疗效，合成多肽足够长，能够诱导产生多种MHC Ⅰ类分子和MHC Ⅱ类分子表位。这种含有23～45个氨基酸的多肽通过皮下给药具有很好的临床疗效，其机制可能是因为合成多肽在处理和呈递通路上更高效，从而能够激活T细胞。

此外，一种全肿瘤抗原蛋白疫苗已经进行了Ⅲ期临床试验，这种疫苗也能摄取处理和提呈多种MHCⅠ类分子和MHCⅡ类分子抗原表位(但是可能效率相对低下)。我们在这种疫苗中加入了优化佐剂，但到目前为止该试验还没有达到他的主要临床终点，试验结果正在分析中。

我们可以同时输入多种多肽疫苗，这样可以针对多种抗原并产生多种T细胞克隆。一项研究表明，含有多种多肽的疫苗与环磷酰胺联合GM-CSF对患者生存期的提高与抗原应答的广度以及循环调节T细胞(Tregs)和骨髓来源的抑制性细胞(MDSCs)的减少有关。

小鼠模型实验表明多抗原多肽疫苗联合化疗是有效的。多肽疫苗可以用于预防癌前病变向癌症进展。最近正在开展一项关于黏蛋白1TAA多肽抗原疫苗的临床试验。结果表明，该疫苗在39个受试者中，几乎一半的人具有高度免疫原性。更值得关注的是，超过半数的晚期结肠癌患者富含免疫抑制性的髓源性抑制细胞(MDSCs)。这表明这类细胞也许可以作为一种免疫应答的生物标志物(循环中的MDSCs细胞的数量)。而且，也许我们需要更早期接种疫苗，因为癌前病变可以诱导产生全身性的免疫抑制。

以APCs为基础的疫苗

许多APCs用于制备疫苗，包括外周血中的单核细胞、活化的B细胞，以及更常见的树突状细胞。树突状细胞是最强的APCs。他能够高效地摄取抗原并获取他们的环境，然后树突状细胞处理这些抗原并提呈给CD4^＋和CD8^＋T细胞。同时启动免疫应答的起始分子(包括分泌细胞因子如产生1类免疫应答的IL-12、P70)，从而决定免疫应答的类型。1类免疫应答产物包括干扰素γ、IL-2、肿瘤坏死因子，他们能够促进产生活化细胞毒CD8^＋ T细胞。最近有一些综述总结了APCs疫苗的发展历史、生物学研究和临床应用。

树突状细胞

关于树突状细胞疫苗的临床试验常常是单中心的，包含一些个案以及缺乏对照组的单臂试验。因此很难设定对照组并且得出不同方法疗效比较的可靠结论。树突状细胞疫苗策略应用了单核细胞和CD34^＋的祖细胞、肿瘤溶解产物，以及正常抗原、肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原或合成的MHC Ⅰ限制性多肽。疫苗的注射方法也各异，包括注入血液、皮肤(皮下或皮内)以及淋巴结。所有以上的这些因素都可能会影响树突状细胞疫苗的临床疗效。初步的结论是树突状细胞疫苗是安全可行的，具有免疫原性，并能促进一些患者发生具有临床意义的肿瘤消退。

基于树突状细胞疫苗的临床试验(2004—2012年)发表得越来越频繁。试验结果表明，利用黏蛋白1脉冲致敏树突状细胞疫苗联合PADRE肽(皮下给药)在肾癌患者中有显著的疗效和免疫反应性。黏蛋白1在NCI的推荐名单中排名靠前。这些树突状细胞疫苗与低剂量IL-2联合应用。在另一项研究中，急性髓系白血病患者接受标准化的治疗在病情缓解后，再给予载有WT-1的树突状细胞疫苗(见术语表)。通过TAAs的mRNA和患者的病情变化都证实上述治疗具有激活免疫系统和提高临床疗效的作用。WT-1也是NCI的推荐名单中排名很靠前的抗原。另一项利用树突状细胞与肿瘤细胞融合制备的瘤苗试验在自体造血干细胞移植前后的患者中显示，能够激活抗肿瘤免疫并使肿块缩小。有趣的是，这些试验都使用了树突状细胞疫苗联合其他治疗手段的策略，即载有疫苗的抗原联合标准治疗和全身性的细胞因子治疗。笔者总结了最近的关于树突状细胞疫苗的试验。

肿瘤细胞疫苗

早期癌症疫苗研究显示，肿瘤细胞能激活小鼠的免疫机制，从而杀死肿瘤细胞并产生包括GM-CSF在内的免疫刺激细胞因子。临床试验证实，用一种能分泌大量GM-CSF的转染肿瘤细胞(G-Vax：见术语表)，包括同源、自体或异体肿瘤细胞都具有一定的免疫性和临床疗效。基于自体肿瘤细胞制备疫苗是可行的，但是制造很复杂。

细胞系

有学者对异体细胞系进行了研究，有单独应用异体细胞系的，也有联合自体肿瘤细胞的研究。G-Vax平台仍然受到研究者的追捧，他是"prime boost"(见术语表)联合疫苗研究的一部分，该研究中胰腺癌患者接种表达TAA间皮素的重组李斯特菌，联合或不联合含有两种异体胰腺癌细胞株的G-Vax。细菌通过激活TLRs和外源性病原体模式识别受体(见术语表)来模拟自然感染的环境。

其他一些基于自体肿瘤抗原的疫苗策略包括使用肿瘤裂解物负载APCs，以及融合肿瘤细胞和自体APCs。这些方法已经通过了早期的临床试验，而且有一部分显示具有显著的临床疗效。未明确的肿瘤细胞裂解产物和外源性辅助蛋白的免疫性也在一些案例中得到了证实。

自体肿瘤细胞

可以用自体肿瘤细胞的肿瘤性基因组转染APCs(自体细胞系或异体同种细胞系)，从而可以激活免疫系统处理和提呈肿瘤特异的未明确的基因突变产物。

以病毒为基础的疫苗

如上所述，含有病原体的肿瘤疫苗在提呈肿瘤抗原的基础上可以大大增加患者的免疫性。虽然多肽抗原有时含有TLR配体如CpG分子(见术语表)或PolyIC/PolyICLC(见术语表)，但是病原体含有大量复杂的分子可以触发多个免疫活化途径。

人类乳头状瘤病毒(HPV)疫苗Cervarix和Gardasil已获批用于未感染HPV的青少年预防宫颈癌。该疫苗的作用机制是通过激活人体的体液免疫来阻止病毒衣壳蛋白组装成非感染性病毒样颗粒。但是这种疫苗对肿瘤患者无治疗效果，只能用于预防。

包括腺病毒在内的一些病毒已作为载体承载肿瘤抗原注射到肌肉组织以达到直接免疫的作用，这利用了肌肉组织天然容易感染病毒的特性。病毒也用于体外抗原转导给APCs，每种病毒对这些转导细胞具有独特的作用，从激活到抑制。病毒直接感染会诱导中和抗体反应，阻止了其重复使用，而在体外转导抗原给APCs抗体中和反应便大大减低。然而，病毒载体的临床应用涉及到一系列复杂的问题，包括可用于临床的病毒制备的要求。

有一种方法能够解决这一问题，就是利用带有肿瘤抗原的外源性病毒骨架的"prime boost"病毒。在前列腺癌患者中使用牛痘病毒和鸡痘病毒"prime boost"就是这种方法的一个例子，因为前列腺癌患者能够表达TAA、PSA，以及共刺激分子B7-1(CD80)、细胞间黏附分子-1(CD54)、淋巴细胞功能相关抗原3(CD58)。这种充满前景的方法提高了前列腺癌患者的生存期，有很多相关的后期临床试验正在进行。该研究小组同时还研究了病毒编码的CEA和黏蛋白1来治疗其他恶性肿瘤。

溶瘤病毒已使用了几十年。他们包括驱动早期基因转录激活因子E1A和E1B(见术语表)的腺病毒和能够刺激病毒复制的肿瘤特异性启动子[包括启动子驱动的TAAS如甲胎蛋白、PSA、人端粒酶逆转录酶(hTERT)]。也有人使用痘苗病毒。有一种方法就是使病毒性serpin(丝氨酸蛋白酶抑制剂)基因产生突变从而提高病毒复制和死亡的选择性，此外，研究者们还在尝试联合趋化因子或共刺激因子的方法。

还有人利用疱疹病毒作为溶瘤病毒来制备癌症疫苗。一个很有前景的方法就是将GM-CSF作为一种佐剂或APC生长因子整合到疱疹病毒载体中。最近在黑色素瘤患者中开展的一项随机Ⅲ期临床试验中的T-VEC就是这种载体。试验结果显示这种载体对ⅢB-Ⅳ期黑色素瘤患者有26%的客观有效率与11%的临床完全缓解率。研究者将重点研究这种疗效的免疫机制。

还有什么可以作为"癌症疫苗"？

肿瘤消融

一些肿瘤消融技术可以去除或大或小的肿块，而这个过程可以同时消弱全身和瘤内的抑制性环境。消除或减少肿瘤体积可以减少一系列由抑制因素所引起的肿瘤，同时使濒死肿瘤细胞释放肿瘤抗原。

射频消融术

这种局部加热技术能引起坏死炎症反应，并且能够暂时重建识别TAA甲胎蛋白的循环性抗肿瘤效应细胞。虽然这些记忆细胞有一定的作用，但是单独应用并不能取得显著的临床疗效。一项肝癌患者的大样本研究发现，射频消融增强了记忆细胞的应答反应，同时还产生了针对多个肿瘤相关抗原的新效应细胞。这种免疫应答与预防肿瘤复发正相关，与MDSCs数量负相关。射频消融术还能提高自然杀伤细胞活性。

高强度聚焦超声

有学者正在研究高强度聚焦超声单独应用或与其他治疗联合应用对免疫反应的激发作用。初步结果显示高强度聚焦超声能够影响STAT5(信号传导及转录活化因子5)信号通路、增加细胞毒性T细胞的效应，并改变组织结构。肿瘤栓塞(治疗性血管封锁)也能够重建循环性TAA特异性CD4^＋T细胞。临床疗效与这些T细胞的出现频次和功能相关。

冷冻消融

肿瘤的冷冻消融技术也可使机体释放TAAs，从而激活抗肿瘤免疫反应。

化疗

过去10年对于小鼠模型的研究显示，不同类型的化疗药在诱导肿瘤细胞死亡的机制上有很大区别(例如有的是坏死，有的是凋亡)。具体的诱导死亡信号分子也对免疫力有影响。肿瘤细胞表面的钙网蛋白上调，机体释放的ATP、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)和肿瘤抗原都能诱发"免疫原性"死亡。传统上认为化疗会使白细胞减少，易造成免疫抑制。然而，白细胞损失的同时，循环调节性T细胞(Tregs)和MDSCs的数量也会减少，并且肿瘤细胞分泌的免疫抑制细胞因子和生长因子也会减少。而且化疗还能释放能被内源性APC摄取的肿瘤抗原，并减少肿瘤负荷。某些化疗药物联合免疫治疗对于抗肿瘤免疫具有协同作用。笔者总结了近期该领域的临床试验。

放射治疗

放疗通过使基因组DNA损伤诱导被照射组织的细胞死亡。此外，放疗不仅可引起照射部位的肿块缩小，也可造成未照射部位的组织损伤，这种现象被称为"远端效应"。该效应证实是由免疫系统介导的。最近有一项临床病例报告显示，在机体具有广泛的免疫监视情况下，放疗诱导的远端效应不仅能够诱导机体产生大量针对TAA的抗体，而且还具有强大的T细胞活化效应。在小鼠模型的动物实验中，同样显示放疗能够诱导肿瘤反应性T细胞的活化。笔者回顾了最近放疗的免疫效应的相关文章。

靶向治疗

结合信号转导分子活性位点的小分子物质的出现是癌症治疗的一项重大突破，这些信号转导分子能够驱动和阻碍肿瘤细胞的增殖。然而，许多小分子靶向药物的特异性不高，也可作用于正常组织和其他的信号通路，并且它们还可导致代偿性的突变，这些都限制其临床疗效的稳定性。

靶向治疗同样具有免疫效应。BRAF抑制剂威罗菲尼增加了黑素瘤患者肿瘤细胞TAA的表达，从而增强了机体对肿瘤细胞的免疫识别能力。有一项研究中黑色素瘤患者接受BRAF抑制剂加或不加促分裂原活化蛋白激酶(MEK)，取患者组织活检发现TAA的表达增加，而且具有更多的CD8^＋ T淋巴细胞浸润，同时还观察到了细胞表明的免疫抑制标记物减少。最近小鼠模型的动物实验发现接受过BRAF抑制剂处理的小鼠肿瘤组织中有更多的肿瘤特异性T细胞浸润。

优化癌症疫苗的策略

癌症疫苗在临床试验中显示的疗效有限。虽然许多试验显示有一部分晚期癌症患者有很好的临床疗效，但是很少有试验能够获得5%～10%的部分缓解(PR)或完全缓解(CR)。有一个原因是大量的平台还处在研发中。有一些是目前已有的异体的、合成的多肽、蛋白质或病原体疫苗。还有一些是自体肿瘤细胞疫苗或APC疫苗，这些疫苗有着诱人的前景。

嵌合抗原受体(CAR)疗法(见术语表)的发展就是癌症疫苗优化策略的一个很好的例子。CAR疗法已经发展到了第三代，从CD3ζ链，经历了增加CD28或4-1BB区域，到后来的应用CD27、CD28、ICOS、4-1BB和OX40多信号结构域构建体。电穿孔转染以及重组逆转录病毒载体转染、慢病毒载体转染都是比较常用的转染方法。CAR疗法的概念一提出，就有人利用免疫耗竭方法和细胞因子支持策略来产生负载CAR的永久细胞。CAR疗法的成功是基于几十年艰苦细致的工作，由一批敬业的研究者组成的许多研究小组坚持不懈的工作确定其结构、调控中心、作用机制、靶器官，以及能够增加CAR负载细胞的联合治疗。同样地，"癌症疫苗"领域尚需要继续完善多疫苗平台技术水平来提高其临床疗效。

动物模型并不总是能够预测临床疗效

最近的一些评论讨论了动物模型的角色地位，以及我们对于遗传工程设计的基因突变动物模型的需求。这些突变的小鼠能够自发的形成肿瘤(包括人类所有的肿瘤)并发生远处转移。皮下植入体外培养的肿瘤在一些短期的简单的动物实验中显示了一定的免疫反应性，但是其中许多在临床上并未获得显著的疗效。

例如，DNA疫苗在小鼠模型和人体研究中的疗效迥异。这种简单、安全、廉价的方式在几例小鼠模型中均表现出强效的免疫原性和令人称奇的治疗效果。在小鼠中，一部分疗效与细菌来源的质粒骨干CpG二核苷酸有关，而且能够表达TLR9的髓细胞和浆细胞样树突细胞。同样的方法在人体中测试时，单独的注射DNA大多无效而且几乎没有免疫原性。随后的研究添加了更有效的佐剂；改进了的给药途径，包括体内注射；以及用DNA启动紧接着用病毒疫苗增强和维持的prime boost策略。这些研究结果取得了可喜的成果。

研究存在的问题

最近有学者开展了一些关于癌症疫苗能够阻止癌前病变向癌症进展的研究。那么，他们是否应该利用多种癌症疫苗平台进行更加深入的研究？

免疫生物标志物对于提供免疫应答标准化的基准、监测免疫抑制水平以及预测临床结局的预后标志物都是至关重要的。那么，临床研究中是否也应该强调这些因素呢，尤其是对于血液和肿瘤标本的研究？

基于患者特异性细胞的疫苗，以及基于肿瘤细胞、多肽表位的自体的、个体化的治疗策略具有强大的免疫潜能，能够激活肿瘤特异性和高亲和力T细胞的免疫反应。那么，我们是否应该优先考虑使用这种策略呢？

争议

2004年，一项引人注目的综述总结了许多癌症疫苗的临床试验，最终得出癌症疫苗最低有效率为3.8%(有效率最高的是树突状细胞疫苗，为7.1%)。该文章还指出，癌症疫苗(包括树突状细胞)的影响因素仍待进一步检测，用于鉴别适应人群和最佳疫苗的生物标志物亦待进一步验证。

另一篇文章讨论了在免疫治疗的抗原靶向性问题中存在的争议。如上所述，现在运用的绝大多数抗原是在肿瘤组织中过度表达的非突变共有型抗原。该文章探讨了一些意外的不良事件、严重毒性反应，以及负载有T细胞受体或非突变自身抗原的特异性CARS的过继性高亲和力淋巴细胞致死事件。本文作者重点探讨病毒抗原，例如HPV抗原(与宫颈癌以及头、颈部癌症密切相关)、EB病毒抗原(与鼻咽癌和淋巴瘤相关)、基因突变所产生的抗原(HLA-A2^＋患者中的KRAS突变)，以及类似于CD19的抗原。最终要能够使正常细胞的毒副反应完全消失，癌症细胞在一个安全或者可接受的毒性水平。

目前的技术和小鼠模型都不能完全模拟这些靶抗原的生物性能，也不能完全预测正常组织中产生毒副作用的因素，包括抗原表达水平、T细胞受体或CARS的表达水平，以及同源抗原的交叉反应性。共有抗原可能是"安全"的靶点，因为癌症疫苗会自然地主动或被动地选择内源性T细胞族群。但是，当输入大量的过继性具有高亲和力的T细胞时，或长期甚至永久消除了能够表达靶抗原的细胞时，共有抗原也会变得不安全。利用CAR T细胞在一个可接受的水平清除CD19^＋B细胞群的毒性反应。

癌症疫苗临床试验免疫监测的经验教训

虽然许多癌症治疗手段的机制尚不完全明确，但却成功地应用了几十年。其中有一些机制已经明确，这对于患者分类、分层、判断预后，以及选择最佳的联合治疗方案都是非常重要的。

如果不考虑平台的变化，那么所有癌症疫苗的主要作用机制都是相同的，即活化肿瘤特异性T细胞。现在癌症疫苗已经克服了可行性、安全性、免疫原性、生物活性和疗效等方面的障碍(尽管是在一小部分患者当中)。那么关键的问题则在于：

什么因素导致了疫苗活化T细胞治疗失败？

怎么样制备和输注疫苗才能有效地激活抗肿瘤的T细胞？

哪些患者最有可能对癌症疫苗有效？

对癌症疫苗来说，预防是最好的临床结局吗？

要回答这些问题，我们需要对免疫监视和疫苗进行详细的分析(图3)。癌症免疫治疗协会与NCI和FDA一道成立了一个工作小组专门负责调研这些问题，并作出相应的建议。这份报告更新了协会以前的研究成果，吸取了许多重要的建议包括有来自全球免疫监测方面的知名专家以及他们的研究成果。

具体而言，为了明确抗肿瘤T细胞的关键生物学特性，我们不仅需要评估反应率和肿瘤反应性T细胞的表型，还需要评估机体产生的细胞因子、效应分子和趋化因子。多项试验都显示，免疫性TAA表位产生的多肽特异性CD8^＋T细胞在血液循环中大量存在，但这与临床疗效并无显著的相关性。这可能是成功接种疫苗之后的表现。

当疫苗中含有多个抗原的多肽时便会产生意想不到的效果。在一些试验中观察到，这些复合多肽的反应广度与临床疗效具有相关性。过去10年里涌现出越来越多的设计完美、操作严格的临床试验，并且对CD8^＋和CD4^＋T细胞、自然杀伤细胞和抗体反应性等多方面进行了评估。

证实免疫措施与临床结局相关的例子

有一个研究给一位外阴上皮内瘤变患者接种来自HPV-16的长肽结果证实，免疫措施与临床结局之间具有相关性。研究者检测到淋巴细胞的增殖，以及促进免疫性抗原和Tregs产生的细胞因子。治疗有效的患者表现为淋巴细胞增殖、最高水平的干扰素γ和IL-5，以及最低水平的Tregs。

有一个试验给予急性髓系白血病患者接种TAA WT-1的疫苗，结果发现治疗有效的患者中WT-1特异性CD8^＋T细胞数量显著增加，而且活化了更多的循环自然杀伤细胞。

另一个在黑色素瘤患者中开展的大型多中心临床疫苗试验的结果显示，复合多肽疫苗表位的免疫性与临床结局具有相关性。该试验采用两种测量方法来测定特异性免疫：MHC四聚体流式细胞仪测定疫苗抗原特异性T细胞的数量；ELISPOT(酶联免疫斑点法)测定外周血单个核细胞释放的干扰素γ的数量。结果显示，酶联免疫斑点法检测结果与总生存率相关，然而MHC表型四聚体检测结果却与临床疗效无关，即使有疫苗特异性T细胞的数量增加。

在一项应用复合多肽疫苗治疗肾癌患者的试验中发现，抑制Tregs能够增强抗肿瘤免疫。MDSCs在基线上的特定亚群数量至关重要，而且临床疗效与应答的多肽数量有关。

预后标志物

其他潜在的预后标记物包括外围血细胞分泌的细胞因子、裂解颗粒和趋化因子，我们将其称之为"polyfunctionality"。

另一个重要参数是肿瘤中免疫细胞的浸润。在黑素瘤患者中，淋巴细胞浸润的速度和强度与患者预后密切相关。最近发现，化疗前结直肠癌患者中出现T细胞浸润是预后良好的一个重要标志物。尽管抗原特异性并不清楚，但是浸润的细胞多是CD3^＋/CD8^＋/CD45R0^＋的细胞，也可能是所有这些细胞全部浸润肿瘤组织。

通过组织分析和分子水平处理替代免疫组化的方法，鉴别出了黑素瘤患者的预后标志物，包括1型干扰素。

患者的特异性因素

影响患者抗肿瘤反应的因素表现在几个水平上。对基线肿瘤特异性T细胞的分析可以识别出那些能够促进现有免疫反应的患者。对基线循环抑制细胞的分析能够鉴别出那些由于过多的Tregs和MDSCs而不太可能出现反应的患者，以及那些应用联合治疗策略能够削弱免疫抑制的患者。

我们对血浆或血清中的大量细胞因子进行检测，结果表明同样具有免疫偏移(偏移向了2型免疫调节或抑制反应，涉及有IL-4、IL-5、IL-13和其他不支持毒性CD8^＋T细胞的分子)，并且表明需要阻断或者增强细胞因子才能取得最佳疗效。对患者特异的小核苷酸多态性的遗传分析可以识别那些改变了基因表达模式的亚群。

最后，如上所述，肿瘤组织已经浸润或发炎的患者，如果想获得持续的免疫应答，需要加入增强剂或检查点阻断剂(抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体；见术语表)，检查点阻断剂能够使免疫细胞扩增或解除免疫阻遏。与此相反，肿瘤组织未被浸润的患者则是接种疫苗来激发抗肿瘤免疫反应的最佳人群。

笔者回顾了近期各种检测这些不同免疫参数的方法。

新兴疗法：癌症疫苗组合

如上所述，一些最新的和相对成功的疫苗策略都包括有疫苗联合应用策略以及疫苗联合标准治疗的策略。在小鼠模型研究的基础上，有研究将针对不同TLRs的几种佐剂混合物与疫苗联合应用，并展现出很好的前景。

"Prime-boost"疫苗从根生上来说也是一种联合疫苗。癌症疫苗的目的是为了提高患者过继性T细胞(提呈最佳的肿瘤抗原)的存活时间和功能。这些疫苗都是从小鼠模型的动物实验开始研究，现在已经进入了临床试验阶段。

由于许多抗原已被证明具有免疫原性而且是安全的，因此复合抗原的使用也变得更加普遍。在应用疫苗后，有研究正在探讨消除肿瘤的许多治疗手段是否引起了免疫抑制性Tregs和MDSCs的增加。

最后，癌症疫苗与检查点阻断剂(抗-CTLA-4抗体，抗PD-1抗体)的联合应用将是今后研究的趋势(图4)。因为免疫系统具有自我调节作用，活化的T细胞能够上调CTLA-4的PD-1，机体还能激活抑制T细胞活性的其他细胞表面分子。单独应用抗CTLA-4抗体结合抗PD-1抗体已经显示出显著的临床疗效，如果将这些抗体和癌症疫苗联合应用将进一步增加每一种疫苗的抗肿瘤反应。

结论

癌症疫苗的领域涵盖了一系列能够促进肿瘤特异性免疫应答的策略。我们已经证实了TAAs的安全性和免疫原性，而且一些临床试验显示基于TAAs的疫苗能够产生客观的临床反应。为了提高免疫应答，一些新的临床试验正在开展关于复合抗原、患者特异性突变抗原、病毒载体、prime-boost策略，以及联合标准治疗的策略的相关研究。